Forma sugerida de citar:

Lozano Camelo, O., Rojas Arias, A., Ávila Méndez, K. y López-Pazos, S. (2022). Preservación modificada y descripción de la fungalisina para Batrachochytrium dendrobatidis. La Granja: Revista de Ciencias de la Vida. Vol. 36(2):32-44. http://doi.org/10.17163/ lgr.n36.2022.03

1 Introducción

Existen varias causas de reducción de la población de anfibios, entre ellas el consumo comercial; las especies introducidas, el uso de la tierra, los contaminantes, el cambio climático, y los patógenos. Hay más de 4.000 especies relacionadas con los anuranos; adicionalmente, las áreas tropicales de América tienen una alta diversidad de anuranos (32% están en Sudamérica). Por ejemplo, la región de Cali (Colombia) tiene un alto índice de diversidad anurana (35 especies), el área de Pichincha (Ecuador) tiene una alta riqueza de especies anuranas (20 especies), y la región de Bolívar (Venezuela) reportó 26 especies (Duellman, 1988). Colombia tiene una riqueza de especies anuranas (Flechas y col., 2017; Lynch, Ruiz-Carranza y Ardila-Robayo, 1997), pero hay más de 50 especies amenazadas (Fisher y Garner, 2020; Sluijs y col., 2017; Rueda-Almonacid, Lynch y Amézquita, 2004). Las enfermedades infecciosas son uno de los factores que afectan el estado de los anuranos, y entre ellas se encuentra la quitridiomicosis, una enfermedad causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis, que tiene efectos dañinos en ranas y sapos en todo el país. B. dendrobatidis tiene afinidad con la dermis queratinizada (Lindauer y col., 2019; Green, Gray y Miller, 2010; Vredenburg y col., 2010; Berger y col., 1998) y parece afectar a los anuranos de acuerdo con las especies, la síntesis de alcaloides, o la relación entre la piel y la temperatura ambiental. B. dendrobatidis aumenta durante el período de lluvia, pues los ecosistemas de agua estimulan la presencia de patógenos en el hospedador (Richmond y col., 2009); por ejemplo, se ha reportado la enfermedad en un total de seis áreas en Colombia: Amazonas, Boyacá, Cauca, Cundinamarca, Nariño y Valle del Cauca, que tienen un clima tropical con poca variación de temperatura y alta humedad (Flechas y col., 2017; Vásquez-Ochoa y col., 2012; Velásquez y col., 2008).

B. dendrobatidis consta de dos etapas: una etapa de zoospora que es móvil y flagelada, y que inicia la colonización en la piel de la rana. Una vez dentro de un huésped, la zoospora puede desarrollar un tejido que se convierte en un zoosporangio (o esporangio), que contiene la siguiente generación de esporas, renovando el ciclo. El zoosporangio prematuro está presente en las células viables que causan hiperqueratosis y alteración del equilibrio hídrico-electrolito, y el zoosporangio maduro predomina en los estratos queratinizados exteriores. Los tubos de descarga se encuentran en la superficie de la piel de la rana, liberando zoosporas en el medio ambiente (Rosenblum y col., 2010). El genoma de B. dendrobatidis tiene una alta tasa de cambio en los linajes, promoviendo una evolución patógena: la NPH (la nueva hipótesis del patógeno) que se basa en un modelo de propagación invasor en nuevos ecosistemas o huéspedes, y LA EPH (la hipótesis del patógeno endémico), que se centra en la enfermedad causada por B. dendrobatidis como consecuencia de una alteración entre patógeno-anura-ambiente (Scheele y col., 2019; Rosenblum y col., 2009).

La Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) (OIE-World Organization for Animal Health, 2012) describió el método de crioconservación de B. dendrobatidis, que se basa exclusivamente en el cultivo de microorganismos para aumentar la concentración de zoosporas y zoosporangio; este consiste en el uso de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 10% de suero fetal bovino (FBS) a −80 ◦C. Durante la descongelación, los cultivos deben someterse a 43 ◦C, lactosa y antibióticos.

La evidencia sugiere que la actividad enzimática de B. dendrobatidis influye directamente en su grado de patogenicidad. La penetración de B. dendrobatidis en las células epidérmicas de la rana probablemente requiere enzimas digestivas. Una cepa de referencia de B. dendrobatidis se cultiva y se utiliza para producir proteasas, que degradan la caseína y la gelatina. La información sobre las bases genéticas e interacciones a nivel molecular conducen a la expresión génica de proteasas de serina y metalopeptidasa de fundalisina, dos genes relacionados con la patogénesis y que han sido identificados en otros hongos (Rosenblum y col., 2010). B. dendrobatidis sintetiza las fungalisina-metalopeptidasas, una clase de proteínas que son esenciales para los microorganimos como Trichophyton sp. y Microsporum sp. un gen de fungalisina-metalopeptidasas de B. dendrobatidis, que tiene altos niveles de expresión en zoosporangios (McDonald y col., 2020; Rosenblum y col., 2009). Este trabajo evalúa los cambios en el protocolo de la OIE para la criopreservación de B. dendrobatidis y la posterior recuperación de este microorganismo, junto con la descripción in silico de su fungalisina.

2 Materiales y métodos

2.1 Cepa

Se utilizó la cepa B. dendrobatidis EV001, donada la por Universidad de los Andes (Bogotá-Colombia). B. dendrobatidis EV001 representa la primera cepa aislada en Colombia (de Ubaqué, Cundinamarca), que fue recuperada de Rheobates palmatus (Flechas y col., 2013). El medio de cultivo utilizado de B. dendrobatidis corresponde a una mezcla de triptona y gelatina hidrolizada (TGH) (triptona al 1%, gelatina hidrolizada al 0,4%, agar al 1%). Se utilizó caldo de triptona al 1% para la producción de zoosporas, y se examinaron las células de B. dendrobatidis EV001 bajo un microscopio, usando tinción azul de lactofenol y rojo Congo.

2.2 Criopreservación de Batrachochytrium dendrobatidis

Se aplicó un método modificado de conservación de la OIE a B. dendrobatidis EV001. Se diluyó una porción de 2,0 ml de medio de triptona de 1 semana de inoculado con B. dendrobatidis EV001, y 13 ml de medio de triptona fresco en un matraz de cultivo celular de 25 cm², y se incubó a temperatura ambiente durante 4 días con agitación suave. Se hizo un raspado de las paredes del matraz, luego se centrifugó el producto a 1700 g durante 10 min. Se eliminó el sobrenadante, y se suspendió el pellet en 0,6 ml de caldo de triptona que contenía DMSO al 10% y se congeló a −80 ^◦C. Un mes después, el pellet congelado se colocó en baño de agua a 43 ^◦C durante 30 s y se transfirió al medio TGh sin lactosa ni antibióticos. Se utilizó un diseño aleatorio con tres repeticiones.

2.3 Fungalisina para Batrachochytrium dendrobatidis

Se realizó un análisis bioinformático del factor de virulencia similar a la fungalisina utilizando la secuencia de aminoácidos correspondiente del genoma de B. dendrobatidis JAM81 depositado en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (ID NCBI: XP 006675712.1). Se realizó una comparación entre la fungalisina para B. dendrobatidis JAM81 y la fungalisina para Aspergillus (Protein Data Bank ID: 4k90) con Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Se utilizó la herramienta ProtParam de ExPASy (http://www.expasy.org/) para la descripción teórica de la fungalisina para B. dendrobatidis (punto isoeléctrico, peso molecular, hidropaticidad, residuos positivos e índice alifático). Los dominios funcionales se determinaron utilizando la base de datos de dominio conservado (CDD) de NCBI. Se calculó un modelo tridimensional (3D) de la fungalisina para B. dendrobatidis JAM81 mediante el modelado homológico, utilizando el modelo suizo (https://swissmodel.expasy.org/), el cual fue sometido a su perfeccionamiento usando 3Drefine (http://sysbio.rnet.missouri.edu/3Drefine/index.html) y validado aplicando QMEAN (https://swissmodel.expasy.org/qmean/). La figura se visualizó utilizando Jmol (https://www.bioinformatics.org/firstglance/fgij/).

3. Resultados

3.1 Morfología del B. dendrobatidis EV001

Se observó la viabilidad de B. dendrobatidis EV001 mediante el crecimiento en el medio TGH y sus estructuras morfológicas. B. dendrobatidis EV001 muestra colonias granulares y cremosas (Figura 1A). De igual forma, se observa una morfología parecida a una cacerola al usar tinción azul de lactofenol bajo el microscopio, lo cual es una característica de la quitridiomicosis (Figura 1B).

Se cultivó el B. dendrobatidis EV001 en un medio de TGH con el fin de determinar la morfología de las zoosporas, zoosporangios, tubo de descarga y rizoides (Figuras 2 y 3) para establecer los estadios de desarrollo de B. dendrobatidis (Figura 4).

3.2 Método de crioconservación de B. dendrobatidis

El método de crioconservación de B. dendrobatidis basado en el protocolo de la OIE (OIE, 2012) fue modificado como se muestra en la Tabla 1. Se confirmó la viabilidad de B. dendrobatidis EV001 en el medio TGh (Figura 5).

3.3 Análisis bioinformático de la fungalisina

Según el análisis bioinformático, las predicciones muestran que la fungalisina de B. dendrobatidis JAM81 tiene una vida media superior a 20 horas, un peso molecular de 85 kDa, un punto isoeléctrico de 8,33, un índice alifático de 59,68 (tiene una alta tolerancia a la temperatura, similar a otras proteínas), y una hidropaticidad de -0.625 (proteína hidrófila). La fungalisina de B. dendrobatidis se modeló utilizando una fungalisina estándar de Aspergillus como plantilla (PDB: 4k90) (Figura 6) (identidad: 40,75%, cobertura de consulta: 45%, valor E: 1E-82). El modelo teórico 3D corresponde a 368 residuos (46,8%) de Phe 237 a Gly 604 (Figura 7). Los alfa-hélices en el modelo están formados por 126 residuos (34,23%), 46 residuos con una conformación beta-lámina (12,5%) y 196 residuos que forman bucles (53,26%). La señal de EXXXD se encuentra entre los residuos 407 y 411, y la señal EXXXD se encuentra entre los residuos 437 y 441. Sobre la base de los resultados de la CDD, la fungalisina de B. dendrobatidis JAM81 tiene un dominio de PepSY (propéptido peptidasa) que va de Ile164 a Val230, y la región catalítica está entre los residuos Tyr239 y Ala590 (Fernández y col., 2013).

4. Discusión

4.1 Morfología de B. dendrobatidis EV001

La B. dendrobatidis tiene una primera etapa que consiste en una zoospora flagelada que coloniza la piel de la anura. Posteriormente, las zoosporas de B. dendrobatidis se convierten en talos esféricos que producen nuevas zoosporas reproducidas asexualmente dentro de las células epidérmicas de la piel de la rana, y luego se liberan zoosporas infecciosas en la superficie de la piel (Greenberg y col., 2017; Kilpatrick y col., 2010). Es importante analizar este microorganismo en la medida en que sea relevante para comprender los patógenos emergentes que se diseminan rápidamente (cosmopolitas), además de su naturaleza agresiva hacia los anuranos (Rosenblum y col., 2009). Las interacciones entre anuras y B. dendrobatidis no se comprenden completamente (De León y col., 2019).

Cabe señalar que el zoosporangio de B. dendrobatidis tiene una estructura refractiva y una abundante presencia de zoosporas en análisis de montaje húmedo (Robinson y col., 2020; Berger y col., 1998). Los portaobjetos con azul de lactofenol eran similares a los portaobjetos húmedos. El azul de lactofenol es un agente de tinción a base de azul metílico y lactofenol, el primer componente sirve como colorante de quitina micótica y el lactofenol (fenol, ácido láctico, glicerol, agua) es un medio de montaje (Leck, 1999). El rojo congo ha demostrado ser una excelente herramienta para la identificación de B. dendrobatidis, que actúa de manera similar al azul de lactofenol al teñir la quitina fúngica (Slifkin y Cumbie, 1988). Las características de B. dendrobatidis EV001 corresponden a las observaciones hechas por expertos: presencia de zoosporas, zoosporangio refractivo o tubo de descarga, entre otros (Briggs y Burgin, 2004; Berger y col., 1998).

4.2 Método de crioconservación de B. dendrobatidis

Al mismo tiempo, se aplicaron análisis para la crioconservación tales como pruebas de prácticas asépticas mediante técnicas como el almacenamiento a temperatura criogénica con DMSO al 5%. Un mes después se llevó a cabo el procedimiento de descongelación utilizando el medio TGh. Se determinó que el agitado con el contenedor hacia abajo (tapa abajo) fue positivo para el crecimiento de B. dendrobatidis EV001, junto con los matraces de sellado de cultivo y su mantenimiento en condiciones asépticas de laboratorio. Se evaluaron otros crioprotectores: 10% de leche de la piel, 10% de DMSO con caldo TGhL y 10% de DMSO con caldo TGhL y 10% de FBS. Estos ensayos se realizaron utilizando un congelador a -80 °C y nitrógeno líquido. La evaluación destacó una mejor recuperación con DMSO y FBS a los 4-5 días usando congelación a -80 °C, resultado que fue similar para el nitrógeno líquido a los 7-14 días (Boyle y col., 2003).

Cabe destacar que no se emplearon antibióticos para evitar la contaminación microbiana, lo que reduce la selección artificial (Brem, Parris y PadgettFlohr, 2013). Estos resultados a menudo se pueden lograr con el uso estricto de condiciones asépticas que implican un conjunto de seguridad biológica y la esterilización de material, entre otros procedimientos. El medio de crecimiento también puede contaminarse debido a la triptona, que es la mayor fuente nutricional de los microorganismos. Por lo tanto, se observó contaminación de Penicillium sp. y Bacillus sp. en nuestro trabajo. Otros autores han descrito que la manipulación de B. dendrobatidis requiere un examen periódico de matraces y viales para minimizar el impacto de las variables de contaminación, y que es necesario desarrollar un conjunto apropiado de pasos (al menos cada 14-21 días en agar, al menos cada 4-5 meses en caldo, y almacenamiento a 4-6 ◦C) (Boyle y col., 2003). Se sugiere el uso de lactosa (Flechas y col., 2012), sin embargo, no fue necesario en nuestro estudio. El medio TGH es ideal porque la B. dendrobatidis crece mejor en la triptona o en la leche peptonizada, y no requiere azúcares adicionales, pues la B. dendrobatidis sintetiza las proteasas que pueden degradar la caseína y la gelatina (Piotrowski, Annis y Longcore, 2004).

Por otra parte, la solución salina débil sustituye al agua de los estanques como medio natural de B. dendrobatidis (Boyle y col., 2003). En este trabajo, se omitió una solución salina débil sin efectos sobre la recuperación de B. dendrobatidis. Por lo tanto, se dice que cuando se modifican las condiciones ambientales y fisicoquímicas para este microorganismo, como se ha visto en los medios de cultivo, se pueden producir cambios en el tamaño del zoosporangio (Garces y col., 2003). En cuanto a las observaciones de los estadios del ciclo de B. dendrobatidis, se observó una formación de zoosporangio joven (proceso de germinación), que se puede determinar en el tubo de descarga en caldo de triptona al 1% relacionado con la humedad para la liberación de zoosporas; los tubos más largos se pueden observar en medios líquidos, sin embargo, la liberación de zoosporas debe ocurrir en medios sólidos con apariencia vacía.

Los requisitos de zoosporangio en la piel de la rana pueden ser variables e impredecibles en la ocurrencia, sin embargo, B. dendrobatidis puede ser viable usando caldo de triptona al 1%, y se pueden observar sus rizoides con rojo congo (Berger y col., 2005). Este enfoque puede ser particularmente eficaz para laboratorios más pequeños, especialmente aquellos con recursos limitados, y puede ser muy útil en el estudio de B. dendrobatidis si se aplican buenas prácticas de microbiología.

4.3 El análisis bioinformático de la fungalisina

Los genes relacionados de la fungalisina de B. dendrobatidis (aproximadamente 25) se expresan principalmente en el zoosporangio (76%) y sólo un pequeño porcentaje se expresa en la zoospora (Rosenblum y col., 2008). Se ha descrito la estructura experimental 3D de una fungalisina de A. fumigatus (AfuMep) y se han encontrado parámetros relevantes para estos factores de virulencia, tales como presencia de propéptidos que eliminan las proteasas huéspedes (residuos 19-245), y el dominio catalítico C-terminal (residuos 245-634) que degradan las proteínas de la matriz extracelular (elastina y colágeno). Se encontró que la fungalisina pertenece a las metaloproteasas de zinc M36. En este artículo se describe la fungalisina como una proteína no glicosilada de 68 kDa que contiene una señal catalítica HEXXH para el reconocimiento de átomos de zinc, que implica 12 alfa-hélices (35%) y 22 hojas beta (12%).

La fungalisina de B. dendrobatidis JAM81 cumple con los requisitos de la familia M36 relativos al peso molecular (85 kDa), la eliminación de hélices y láminas, la señal metaloproteasa HEXXH, y un residuo de arginina (470), considerado como el elemento importante en el plegado, y la actividad catalítica de esta enzima, porque las elastasas y las termolisinas tienen un ion de calcio cerca del ion de zinc (16 Å) del sitio catalítico y tienen la capacidad de proteger la enzima de la autolisis. La AfuMep y la fungalisina de B. dendrobatidis JAM81 tienen una arginina 470 que protege estos factores de virulencia (Fernández y col., 2013).

Los mecanismos que subyacen al proceso de la quitridiomicosis no están completamente claros, sin embargo, se han presentado varias hipótesis (Berger y col., 2005). La susceptibilidad de la rana a B. dendrobatidis está relacionada con la forma en que los anfibios toman su agua directamente a través de la piel, preservando la homeostasis animal, y reflejando el hecho de que la B. dendrobatidis inhibe los canales de sodio que están relacionados con la quitridiomicosis. Se determinó que la rana transporta sodio al plasma, por lo que los canales epiteliales de sodio y su influencia en los riñones de anfibios son importantes en este proceso, y existe un deterioro de la función cardíaca antes de la muerte (Campbell y col., 2012). El B. dendrobatidis es un patógeno no específico, y no afecta a todas las especies de anfibios por igual (Strauss y Smith, 2013) posiblemente debido al microbiota cutáneo o péptidos antimicrobianos, y podría desempeñar un papel importante en la defensa contra los hongos (Flechas y col., 2013, Berger y col., 1999). El B. dendrobatidis tiene hospederos y reservorios alternativos como nematodos y cangrejos de río, pero las infecciones en otros vertebrados no son letales (Rosenblum y col., 2010, Strauss y Smith, 2013).

5 Conclusión

Este trabajo muestra una descripción de B. dendrobatidis EV001 como introducción a un método de criopreservación modificado, que sería una contribución significativa para los laboratorios centrados en esta área; de igual forma, se añade un modelo teórico de fungalisina como contribución para comprender los factores de virulencia de este patógeno de anura.

Agradecimientos

Los autores agradecen a S. Flechas y a la Universidad de Los Andes (Bogotá-Colombia) pro brindar las cepas de B. dendrobatidis EV001. No existen intereses económicos ni del sector privado

Referencias

Berger, L., Hyatt, A., Speare, R., and Longcore, J. (2005). Life cycle stages of the amphibian chytrid batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of aquatic organisms, 68(1):51–63. Online: https://bit.ly/3kX4oQp.

Berger, L., Speare, R., Daszak, P., Green, D., Cunningham, A., Goggin, C., Slocombe, R., Ragan, M., Hyatt, A., McDonald, K., Hines, H., Lips, K., Marantelli, G., and Parkes, H. (1998). Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with population declines in the rain forests of australia and central america. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(15):9031–9036. Online: https://bit.ly/3wrwXea.

Berger, L., Speare, R., and Hyatt, A. (1999). Declines and disappearances of Australian frogs, chapter Chytrid fungi and amphibian declines: overview, implications and future directions, pages 23–33. Environment Australia.

Boyle, D., Hyatt, A., Daszak, P., Berger, L., Longcore, J., Porter, D., Hengstberger, S., and Olsen, V. (2003). Cryo-archiving of batrachochytrium dendrobatidis and other chytridiomycetes. Diseases of aquatic organisms, 56(1):59–64. Online: https://bit.ly/3NbJU2p.

Brem, F., Parris, M., and Padgett-Flohr, G. (2013). Re-isolating batrachochytrium dendrobatidis from an amphibian host increases pathogenicity in a subsequent exposure. PLoS One, 8(5):e61260. Online: https://bit.ly/3w3BioN.

Briggs, C. and Burgin, S. (2004). Congo red, an effective stain for revealing the chytrid fungus, batrachochytrium dendrobatidis, in epidermal skin scrapings from frogs. Mycologist, 18(3):98–103. Online: https://bit.ly/3L16jhf.

Campbell, C., Voyles, J., Cook, D., and Dinudom, A. (2012). Frog skin epithelium: electrolyte transport and chytridiomycosis. The international journal of biochemistry & cell biology, 44(3):431–434. Online: https://bit.ly/3P9bcZ7.

De León, M., Zumbado-Ulate, H., GarcíaRodríguez, A., Alvarado, G., Sulaeman, H., Bolaños, F., and Vredenburg, V. (2019). Batrachochytrium dendrobatidis infection in amphibians predates first known epizootic in costa rica. PLoS One, 14(12):e0208969. Online: https://bit.ly/3FFjRhA.

Duellman, W. (1988). Patterns of species diversity in anuran amphibians in the american tropics. Annals of the Missouri Botanical Garden, 14(2):79–104. Online: https://bit.ly/3Fz8AiC.

Fernández, D., Russi, S., Vendrell, J., Monod, M., and Pallarès, I. (2013). A functional and structural study of the major metalloprotease secreted by the pathogenic fungus aspergillus fumigatus. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography, 69(10):1946–1957. Online: https://bit.ly/38f3lso.

Fisher, M. and Garner, T. (2020). Chytrid fungi and global amphibian declines. Nature Reviews Microbiology, 18(6):332–343. Online: https://go.nature.com/3svcXpL.

Flechas, S., Medina, E., Crawford, A., Sarmiento, C., Cárdenas, M., Amézquita, A., and Restrepo, S. (2013). Characterization of the first batrachochytrium dendrobatidis isolate from the colombian andes, an amphibian biodiversity hotspot. EcoHealth, 10(1):72–76. Online: https://bit.ly/3w5GrfO.

Flechas, S., Paz, A., Crawford, A., Sarmiento, C., Acevedo, A., Arboleda, A., Bolívar-García, W., Echeverry-Sandoval, C., Franco, R., Mojica, C., and Amézquita, A. (2017). Current and predicted distribution of the pathogenic fungus batrachochytrium dendrobatidis in colombia, a hotspot of amphibian biodiversity. Biotropica, 49(5):685–694. Online: https://bit.ly/3yvFDmn.

Flechas, S., Sarmiento, C., Cardenas, M., Medina, E., Restrepo, S., and Amezquita, A. (2012). Surviving chytridiomycosis: differential antibatrachochytrium dendrobatidis activity in bacterial isolates from three lowland species of atelopus. PloS one, 7(9):e44832. Online: https://bit.ly/3yvN4d3.

Garcés, E., Correa, B., Coba, M., Orozco, M., Zapata, A., Anacona, A., and Sabogal, S. (2003). Morfología y clasificación de los hongos. Unibiblos.

Green, D., Gray, M., and Miller, D. (2010). Amphibian Ecology and Conservation: A handbook of techniques, chapter Disease monitoring and biosecurity, pages 481–501. Oxford, University Press.

Greenberg, D., Palen, W., and Mooers, A. (2017). Amphibian species traits, evolutionary history and environment predict batrachochytrium dendrobatidis infection patterns, but not extinction risk. Evolutionary applications, 10(10):1130–1145. Online: https://bit.ly/3N8RBXa.

Kilpatrick, A., Briggs, C., and Daszak, P. (2010). The ecology and impact of chytridiomycosis: an emerging disease of amphibians. Trends in ecology & evolution, 25(2):109–118. Online: https://bit.ly/37DRhk2.

Leck, A. (1999). Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health, 12(30):24. Online: https://bit.ly/3sse8pT.

Lindauer, A., May, T., Rios-Sotelo, G., Sheets, C., and Voyles, J. (2019). Quantifying batrachochytrium dendrobatidis and batrachochytrium salamandrivorans viability. EcoHealth, 16(2):346–350. Online: https://bit.ly/3ssGwrI.

Lynch, J., Ruiz-Carranza, P., and Ardila-Robayo, M. (1997). Biogeographic patterns of colombian frogs and toads (patrones biogeográficos de las ranas y los sapos de colombia). Revista de la Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, 21(N80):237–248.

McDonald, C., Ellison, A., Toledo, L., James, T., and Zamudio, K. (2020). Gene expression varies within and between enzootic and epizootic lineages of batrachochytrium dendrobatidis (bd) in the americas. Fungal Biology, 124(1):34–43. Online: https://bit.ly/3MiCXME.

OIE-World Organization for Animal Health (2012). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, chapter Infection with Batrachochytrium dendrobatidis., pages 1–18. World Organization for Animal Health.

Piotrowski, J., Annis, S., and Longcore, J. (2004). Physiology of batrachochytrium dendrobatidis, a chytrid pathogen of amphibians. Mycologia, 96(1):9–15. Online: https://bit.ly/3ssugYC.

Richmond, J., Savage, A., Zamudio, K., and Rosenblum, E. (2009). Toward immunogenetic studies of amphibian chytridiomycosis: linking innate and acquired immunity. Bioscience, 59(4):311–320. Online: https://bit.ly/37DWCb4.

Robinson, K., Pereira, K., Bletz, M., Carter, E., Gray, M., Piovia-Scott, J., Romansic, J., Woodhams, D., and Fritz-Laylin, L. (2020). Isolation and maintenance of batrachochytrium salamandrivorans cultures. Diseases of aquatic organisms, 140:1–11. Online: https://bit.ly/3kYRy3Y.

Rosenblum, E., Fisher, M., James, T., Stajich, J., Longcore, J., Gentry, L., and Poorten, T. (2010). A molecular perspective: biology of the emerging pathogen batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of aquatic organisms, 92(2-3):131–147. Online: https://bit.ly/3w46Jzj.

Rosenblum, E., Poorten, T., Settles, M., Murdoch, G., Robert, J., Maddox, N., and Eisen, M. (2009). Genome-wide transcriptional response of silurana (xenopus) tropicalis to infection with the deadly chytrid fungus. PloS one, 4(8):e6494. Online: https://bit.ly/3ssXneg.

Rosenblum, E., Stajich, J., Maddox, N., and Eisen, M. (2008). Global gene expression profiles for life stages of the deadly amphibian pathogen batrachochytrium dendrobatidis. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(44):17034–17039. Online: https://bit.ly/39V13yY.

Rueda-Almonacid, J., Lynch, J., and Amézquita, A. (2004). Libro Rojo de los Anfibios de Colombia. Conservación Internacional Colombiana.

Scheele, B., Pasmans, F., Skerratt, L., Berger, L., Martel, A., Beukema, W., Acevedo, A., Burrowes, P., Carvalho, T., Catenazzi, A., De la Riva, I., Fisher, M., Flechas, S., Foster, C., FríasÁvarez, P., Garner, T., Gratwicke, B., Guayasamin, J., Hirschfeld, M., Kolby, J., and Canessa, S. (2019). Amphibian fungal panzootic causes catastrophic and ongoing loss of biodiversity. Science, 6434(363):1459–1463. Online: https://doi.org/10.1126/science.aav0379.

Slifkin, M. and Cumbie, R. (1988). Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology, 26(5):827–830. Online: https://bit.ly/3L3Poe8.

Spitzen-van der Sluijs, A., Canessa, S., Martel, A., and Pasmans, F. (2017). Fragile coexistence of a global chytrid pathogen with amphibian populations is mediated by environment and demography. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 284(1864):20171444. Online: https://bit.ly/3sufIHQ.

Strauss, A. and Smith, K. (2013). Why does amphibian chytrid (batrachochytrium dendrobatidis) not occur everywhere? an exploratory study in missouri ponds. PloS one, 8(9):e76035. Online: https://bit.ly/3Pcpc45.

Vásquez-Ochoa, A., Bahamón, P., Prada, L., and Franco-Correa, M. (2012). Detección y cuantificación de batrachochytrium dendrobatidis en anfibios de las regiones andina central, oriental, orinoquia y amazonia de colombia. Herpetotropicos, 8(1-2):13–21. Online: https://n9.cl/qd3q4.

Velásquez, E., Castro, F., Bolivar, G., and Herrera, M. (2008). Infección por el hongo quitrido batrachochytrium dendrobatidis en anuros de la cordillera occidental de colombia. Herpetotropicos, 4(2):65–70. Online: https://n9.cl/wrh4y.

Vredenburg, V., Knapp, R., Tunstall, T., and Briggs, C. (2010). Dynamics of an emerging disease drive large-scale amphibian population extinctions. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(21):9689–9694. Online: https://bit. ly/3Nd79Jv.

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