Artículo cientíﬁco / Scientiﬁc paper

CIENCIAS VETERINARIAS

pISSN:1390-3799; eISSN:1390-8596

http://doi.org/10.17163/lgr.n39.2024.08

DETERMINACIÓN MOLECULAR DEL AGENTE ETIOLÓGICO DE LA

MASTITIS BOVINA DE MUESTRAS PROVENIENTES DE UNIDADES

PRODUCTORAS ANDINAS

MOLECULAR DETERMINATION OF THE ETIOLOGICAL AGENT OF BOVINE

MASTITIS FROM ANDEAN PRODUCTION UNITS

Nancy Bonifaz*1, Ximena Galarza2, Byron Fuertes3y Janss Beltrán1

1Grupo de investigación NUNKUI WAKAN, Universidad Politécnica Salesiana, Campus el Girón: Isabel la Católica N.23-52 y

Madrid, Quito, Ecuador.

2Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública-INSP, Iquique y Yahuachi, Quito, Ecuador.

3Carrera de Biotecnología, Universidad Politécnica Salesiana, Campus el Girón: Isabel la Católica N.23-52 y Madrid, Quito,

Ecuador.

*Autor para correspondencia: nbonifaz@ups.edu.ec

Manuscrito recibido el 17 de junio de 2021. Aceptado, tras revisión, el 15 de julio de 2022. Publicado el 1 de marzo de 2024.

Resumen

La mastitis bovina es una enfermedad que afecta a las ganaderías de pequeños y medianos productores de los can-

tones Cayambe y Pedro Moncayo, Provincia de Pichincha-Ecuador. El tratamiento de esta enfermedad resulta com-

plicado debido a la variedad de microorganismos que la provocan. El presente estudio se enfocó en la determinación

molecular por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los agentes etiológicos de la mastitis. Esta

técnica presenta múltiples ventajas al reconocer familia, género y especie de microorganismos, y es un método capaz

de detectar genes de resistencia de antibióticos, lo que resulta importante al momento de diagnosticar y tratar enfer-

medades. El objetivo de esta investigación se centró en la identiﬁcación de bacterias causantes de la mastitis bovina,

utilizando pruebas bioquímicas y moleculares. Las pruebas bioquímicas como tinción Gram, Catalasa, Coagulasa, y

Agar Manitol Sal fueron eﬁcientes para obtener cepas puras y determinar el género de algunas bacterias. Se utilizaron

primers especíﬁcos (RNA16S) para la identiﬁcación molecular de 9 agentes etiológicos causantes de la enfermedad

en las unidades productivas. Los microorganismos encontrados fueron; Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus warneri,

Staphylococcus sp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Sphingomonas sp., Strep-

tococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, la mayoría presentes en mastitis clínica. Para detectar genes de resistencia se

utilizaron primers especíﬁcos, de los cuales 7 muestras presentaron el gen para resistencia a blaTEM (β-lactámicos)

y 6 muestras presentaron el gen para resistencia a tetA (tetraciclinas). Se identiﬁcó multirresistencia en las especies:

Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus uberis, Sphingomonas sp.

Palabras clave: Mastitis, PCR, secuenciación, bioquímica.

137 LAGRANJA:Revista de Ciencias de la Vida 39(1) 2024:137-149.

Artículo cientíﬁco/Scientiﬁc paper

CIENCIAS VETERINARIAS Bonifaz, N., Galarza, X., Fuertes, B. y Beltrán, J.

Abstract

Bovine mastitis is a disease that affects the farms of small and medium producers in the cantons of Cayambe and

Pedro Moncayo, Pichincha Province-Ecuador. Treating this disease is not easy due to the different microorganisms

that cause it. This study focused on the molecular determination by means of polymerase chain reaction (PCR) of the

etiological agents of mastitis, having multiple advantages when recognizing family, gender and species of microor-

ganisms. It is a method capable of detecting resistance genes of antibiotics, an important analysis when diagnosing

and treating diseases. The aim of this research is to identify bacteria causing bovine mastitis by using biochemical and

molecular tests. Biochemical tests such as: Gram staining, Catalase, Coagulase, and Mannitol Salt Agar were efﬁcient

to obtain pure strains and determine the gender of some bacteria. Speciﬁc primers (RNA16S) were used for the mo-

lecular identiﬁcation of 9 etiological agents causing the disease in the productive units. The microorganisms found

were Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus warneri, Staphylococcus sp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus saprophyticus, Sphingomonas sp., Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, mostly present in clinic

mastitis. To detect resistance genes, speciﬁc primers were used, of which 7 samples presented the gene for resistance

to blaTEM (β-lactam) and 6 samples presented the gene for resistance to tetA (tetracyclines). Multi-resistance was

identiﬁed in the species Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus uberis,

Sphingomonas sp.

Keywords: Mastitis, PCR, sequencing, biochemistry.

Forma sugerida de citar: Bonifaz, N., Galarza, X., Fuertes, B. y Beltrán, J. (2024). Determinación molecular

del agente etiológico de la mastitis bovina de muestras provenientes de unidades

productoras andinas. La Granja: Revista de Ciencias de la Vida. Vol. 39(1):137-149.

http://doi.org/10.17163/lgr.n39.2024.08.

IDs Orcid:

Nancy Bonifaz: http://orcid.org/0000-0002-1029-057X

Ximena Galarza: http://orcid.org/0000-0001-9181-3354

Byron Fuertes: http://orcid.org/0000-0003-4045-6195

Janss Beltrán: http://orcid.org/0000-0002-5035-7863

138 LAGRANJA:Revista de Ciencias de la Vida 39(1) 2024:137-149.

Determinación molecular del agente etiológico de la mastitis bovina de muestras provenientes de

unidades productoras andinas

1 Introducción

Según INEC y ESPAC (2016), en el Ecuador se pro-

ducen 6’202.408 litros de leche diarios, en la región

Sierra 4’810.551 litros, (el 75% de la producción na-

cional), y en la provincia de Pichincha 873.272 litros.

Torres (2018) estima que el cantón Cayambe produ-

ce alrededor de 425.000 litros diarios de leche, de

los cuales destinan para el consumo 51.000 litros,

producción artesanal 106.250 litros y venta a gra-

nel 267.750 litros. De la misma manera, Céspedes

y Pachacama (2012), aﬁrman que en el cantón Pe-

dro Moncayo existe una producción diaria de leche

de 13 905 litros diarios.

Bonifaz y Conlago (2016) maniﬁestan que la

mastitis causa grandes molestias a los ganaderos,

provocando una disminución en la producción y

características de calidad de la leche, viéndose afec-

tada en su composición química, física y bacterio-

lógica, presentando un menor porcentaje de sólidos

totales, proteínas, grasa y calcio. Se conoce como

mastitis a la inﬂamación e irritación de la glándula

mamaria causada por diversos agentes patógenos,

presentando aumento de células somáticas y pro-

vocando malestar en el animal; como efecto secun-

dario de esta infección, la textura de la leche cambia

sus características organolépticas (Bhattarai y col.,

2018). Según Martínez (2012), los síntomas clínicos

son aumento en el número de leucocitos, composi-

ción y apariencia alterada (grumos), ﬁebre, cuartos

mamarios enrojecidos, hinchados y calientes.

La aparición de la mastitis depende de las con-

diciones higiénicas de las salas de ordeño (Zhang

y col., 2018), edad, raza, partos, periodo de lactan-

cia, producción de leche y condiciones del equipo

de ordeño. En caso de que no se utilice equipo de

ordeño, se deberá controlar la salud e higiene de la

persona encargada del ordeño de las vacas (Ruiz

Gil, Peña Rodríguez y Remón Díaz, 2016).

La enfermedad aparece también cuando los fac-

tores del medio y el manejo de los animales interac-

túan de tal manera que la ubre es expuesta a micro-

organismos patógenos. Hay tres factores esenciales

que promueven la mastitis, el hospedador, el agente

infeccioso y el medio ambiente (Owens y Nicker-

son, 2011).

Se han realizado estudios donde se identiﬁcan

los agentes etiológicos causantes de mastitis (Cer-

vantes y col., 2017); empleando medios de culti-

vo selectivos se han aislado Streptococcus agalactiae,

Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, E. coli,

Klebsiella, Pseudomona, Candida albicans yProteus mi-

rabilis.

Hernández y col. (2015) en un estudio sobre

identiﬁcación de agentes etiológicos determinaron

que Staphylococcus aureus es el microorganismo más

importante, con un 26% de prevalencia sobre el

total de microorganismos identiﬁcados en el depar-

tamento de Boyacá.

El método estándar para la identiﬁcación de los

agentes patógenos consiste en aislamientos en me-

dios de cultivos selectivos, sin embargo, usando

este método solamente se hará un diagnóstico hasta

el nivel de género de la bacteria (Peña y col., 2012).

La prevalencia de esta enfermedad en el cantón

Cayambe y Pedro Moncayo es preocupante, pues

los microorganismos patógenos responsables cam-

bian continuamente su dinámica ecológica por las

mutaciones que sufren los agentes etiológicos. Por

esta causa se han tomado medidas para identiﬁcar

los agentes patógenos causantes de la mastitis por

medio de pruebas bioquímicas y técnicas molecula-

res que permiten establecer los agentes patógenos y

la resistencia a múltiples antibióticos por el mal uso

de estos al tratar esta enfermedad (Bonifaz y Conla-

go, 2016).

Con base a lo mencionado, los objetivos de es-

ta investigación son determinar mediante técnicas

moleculares los agentes etiológicos de la mastitis

bovina de muestras provenientes de unidades pro-

ductoras de los cantones Cayambe y Pedro Mon-

cayo, así como también identiﬁcar las bacterias de

la enfermedad mediante 3 pruebas bioquímicas, de-

tectar los genes de resistencia blaTEM para betalac-

támicos y tetA para tetraciclinas, en bacterias aisla-

das en esta investigación mediante la técnica PCR

y por último realizar la identiﬁcación molecular de

los microrganismos aislados a través del secuencia-

miento de la región ribosomal RNA 16S.

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2 Materiales y Métodos

2.1 Toma de muestras de leche

Las muestras de leche fueron tomadas en ﬁncas

ganaderas ubicadas en los cantones de Cayambe

(coordenadas 0◦02’38”N 78◦09’22”O) y Pedro Mon-

cayo (coordenadas 0◦02’37”N 78◦20’57”O), las cua-

les habían sido previamente identiﬁcadas como po-

sitivas para mastitis mediante California Mastitis

Test (CMT).

Se colectaron un total de 24 muestras de leche

siguiendo el protocolo LCL 001 del Laboratorio de

calidad de leche de la Universidad Politécnica Sale-

siana, el cual indica que se deben tomar 40 mL de

leche por envase, para su análisis en el equipo FOS-

SOMATIC células somáticas (CCS) por citometría

de ﬂujo. Se seleccionaron para este estudio aquellas

muestras que superaron los 500.000 CCS/dL según

lo determinado por Nieto y col. (2012).

2.2 Aislamiento microbiano

Las muestras de leche fueron sembradas por hiso-

pado en medio Tripteína Soya Agar (TSA), reco-

mendado para la detección y recuento de una am-

plia gama de bacterias, y se incubaron a 37 ◦C por

48 horas (Britania Tripteína Soya Agar, 2015). Poste-

rior a ello, para obtener colonias puras se realizaron

varios subcultivos empleando la técnica de siembra

por agotamiento en medio TSA (Milián y col., 2014).

Se conﬁrmó la presencia de colonias bacterianas pu-

ras mediante tinción de Gram.

2.3 Identiﬁcación mediante pruebas bio-

químicas

Se realizaron cuatro pruebas bioquímicas de identi-

ﬁcación bacteriana: Tinción de Gram para diferen-

ciar bacilos y cocos Gram (+) y Gram (-); Catala-

sa empleando peróxido de hidrógeno al 30%, espe-

rando visualizar presencia o ausencia de burbujeo

(Wanger y col., 2017); Prueba Coagulasa en plasma

humano, donde se inocularon las cepas puras e in-

cubadas a 37 ◦C por 24 horas para analizar presen-

cia o ausencia de coagulación (American Society for

Microbiology, 2016); y Agar Manitol Sal (AMS) en

donde se realizaron siembras de las cepas aisladas

y fueron incubadas a 37 ◦C por 48 horas con la ﬁ-

nalidad de diferenciar bacterias del género Staphylo-

coccus (Vila, Zhurbenko y Viera, 2004). La aplicación

de estas pruebas tuvo como ﬁnalidad evitar que los

análisis moleculares se realicen en especies bacteria-

nas repetidas.

2.4 Extracción de ADN y ampliﬁcación de

la región 16S rRNA

Las cepas puras fueron masiﬁcadas en medio Try-

ptic Soya Broth (TSB) hasta llegar a una concentra-

ción de 12×108(UFC/mL) la cual fue determinada

por comparación con patrones de turbidez de la es-

cala McFarland. En tubos de 1,5 mL se colocó 1mL

de cultivo bacteriano de cada cepa masiﬁcada y la

muestra se centrifugó para formar un pellet de bac-

terias que fue empleado para la extracción de ADN

en base a lo recomendado por Becton et al. (2005).

La extracción de ADN total se realizó empleando el

protocolo de extracción de ADN de Köchl, Nieders-

tätter y Parson (2005). La presencia o ausencia de

ADN fue conﬁrmada mediante electroforesis en gel

de agarosa al 1% (Buitrago, 2010). El ADN obtenido

fue conservado en una solución de Tris-EDTA a -20

◦C (Tan y Yiap, 2009).

La ampliﬁcación de la región 16S

rRNA se realizó usando los primers 27F

(50TCCTACGGGAGGCAGCAGT30) y 1492R

(50GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT30) dise-

ñados por Marchesi y col. (1998). Se usó la técni-

ca PCR, utilizando el termociclador marca Labnet

Multigene bajo las siguientes condiciones: desnatu-

ralización inicial a 95 ◦C por 5 minutos, 25 ciclos de

desnaturalización a 95 ◦C por 1 minuto, annealing

a 60 ◦C por 2 minuto, extensión inicial por 1 minuto

a 72 ◦C y extensión ﬁnal de 7 minutos a 72 ◦C se-

guido de mantenimiento a 4 ◦C (Kang y col., 2015).

Se determinó la presencia de amplicones realizando

electroforesis en gel de agarosa al 1%.

2.5 Secuenciación y análisis de secuencias

Los amplicones fueron secuenciados bajo la técni-

ca de Sanger en MACROGEN, Corea del Sur. Las

secuencias obtenidas se compararon con secuencias

existentes en el GeneBank del Centro Nacional para

la Información Biotecnológica (NCBI).

Posteriormente, las secuencias fueron alineadas

con la herramienta Muscle de software Mega 6 pa-

ra obtener un árbol ﬁlogenético empleando la he-

140 LAGRANJA:Revista de Ciencias de la Vida 39(1) 2024:137-149.

Determinación molecular del agente etiológico de la mastitis bovina de muestras provenientes de

unidades productoras andinas

rramienta neighbor joining de Mega 6 para realizar

una correcta clasiﬁcación taxonómica de los agen-

tes etiológicos aislados (Fuertes y Cerna, 2018).

2.6 Ampliﬁcación de genes de resistencia

a antibióticos blaTEM (β-lactámicos) y

tatA (tetraciclinas)

La presencia o ausencia de genes de resistencia a

antibióticos se determinó empleando los siguientes

primers especíﬁcos descritos por Tao y col. (2014),

para blaTEM: Forward (50GCA CGA GTG GGT

TAC ATC GA 30) y Reverse (50GGT CCT CCG ATC

GTT GTC AG 30) el tamaño aproximado del gen de

resistencia es de 300 pb; para tetA: Forward (50GCT

ACA TCC TGC TTG CCT TC 30) y Reverse (50CAT

AGA TCG CCG TGA AGA GG 30). Según Belding

y Boopathy (2018) el tamaño aproximado del gen de

resistencia es de entre 250 a 300 pb. Los resultados

obtenidos fueron veriﬁcados en electroforesis en gel

de agarosa al 1%.

3 Resultados y Discusión

3.1 Identiﬁcación mediante pruebas bio-

químicas

Se aislaron un total de 17 cepas bacterianas. La tin-

ción Gram dio como resultado 15 especies Gram

positivas y 2 especies Gram negativas, como se in-

dica en la Tabla 1.

Tras la aplicación de las pruebas de catalasa se

identiﬁcaron 11 especies catalasa positivo y 6 es-

pecies catalasa negativo. Las pruebas de coagulasa

permitieron identiﬁcar 1 especie coagulasa positivo

y 16 especies coagulasa negativo. Chaneton (2010),

aﬁrma que los Staphylococcus coagulasa negativos

son los patógenos con mayor predominio, al ser

identiﬁcados en función al tipo de infección 47% en

infección latente y 28% en mastitis subclínica.

Las siembras en Agar Manitol Sal (AMS) permi-

tieron catalogar a 4 especies como positivas a fer-

mentación de manitol, 8 especies negativas a fer-

mentación de manitol y 5 especies bacterianas que

no dieron un resultado determinado.

Tabla 1. Resultados obtenidos de aplicación de pruebas Bioquímicas

Código de la

muestra

Aplicación de Pruebas Bioquímicas

Tinción

Gram Catalasa Coagulasa Agar Manitol

Sal

835 + + - +

A2r + + - +

D2r + + - ****

I2r + + - +

A3r + + - +

809 + + - -

798 + + + ****

799c1 + + - -

H3R + + - -

11 + - - ****

11ª + - - ****

1C - + - -

2C - + - ****

1B + - - -

E1 + - - -

99 + - - -

799 + - - -

Resultado de la clasiﬁcación por pruebas bioquímicas de las

cepas bacterianas aisladas; (+) = Resultado positivo, (-) =

Resultado negativo, (****) = Resultado inconcluso.

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3.2 Identiﬁcación mediante métodos mole-

culares

El ADN total obtenido fue de aproximadamente

7000 pb, basándose en la escalera molecular del kit

Thermo Scientiﬁc 2×Phire Plant Direct (Figura 1).

La ampliﬁcación de la región 16S rRNA dio co-

mo resultado bandas de aproximadamente 1300 pb

(Figuras 2 y 3). La validez de las secuencias obteni-

das fue analizada empleando el software FinchTV,

con lo cual se descartaron 3 secuencias por no contar

con la calidad adecuada. Con las secuencias restan-

tes se obtuvo la identidad de 15 especies correspon-

dientes al dominio Bacteria.

Las secuencias obtenidas en esta investigación

fueron comparadas con secuencias presentes en la

base de datos en el GeneBank del NCBI. Los por-

centajes de identidad superaron el 97% en todos los

casos, a excepción de las cepas codiﬁcadas como 1C,

2C y E1. Sol-Church y Frenck (2014), sugieren acep-

tar porcentajes de identidad superiores al 95%. Las

secuencias de las especies catalogadas como D2r,

798 y 2C no contaron con un registro taxonómico en

la base de datos del NCBI, siendo catalogadas como

bacterias no cultivadas. Para realizar una correcta

identiﬁcación de los agentes etiológicos aislados se

elaboró un árbol ﬁlogenético empleando las 15 se-

cuencias obtenidas y 4 secuencias externas usadas

de referencia descargadas de la base de datos del

NCBI (Figura 4).

Figura 1. ADN total en gel de electroforesis.

Las especies aisladas fueron identiﬁcadas como

agentes etiológicos causantes de mastitis en el gana-

do bovino lechero en la zona de estudio. Basados en

la información obtenida con el árbol ﬁlogenético, se

establecieron tres clados:

- Clado (I): Los aislamientos identiﬁcados como

Staphylococcus sp. (A3r), S. pasteuri (835, A2r),

S. Warneri (I2r), S. epidermidis (809) y S. sa-

prophyticus (799c1), se encuentran en este cla-

do. Existieron especies que no pudieron ser

identiﬁcadas a nivel taxonómico como es el

caso de Bacterium strain 2BL_4 (D2r) la cual

se alineó con S. warneri y una bacteria no cul-

tivada clone ncd2254e01c2 (798), especies que

se agruparon a la secuencia de referencia de

Staphylococcus aureus usada como especie ex-

terna, determinando que estas pueden perte-

necer al mismo género, pero de diferente cepa.

- Clado (II): Incluyen a Sphingomonas sp. (C1)

y Bacterium strain 4BL_5 (2C) agrupadas es-

trechamente con la cepa de referencia tipo

de ATCC Sphingomonas paucimobilis. Esta rela-

ción la conﬁrma Clavijo y col. (2012), ya que

existen géneros que se encuentran dentro de

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Determinación molecular del agente etiológico de la mastitis bovina de muestras provenientes de

unidades productoras andinas

un mismo grupo, comparten características y

coinciden también con la identiﬁcación mole-

cular.

- Clado (III): Todos los aislamientos en el clado

III coinciden al ser del mismo género Strepto-

coccus al agruparse en las siguientes especies

S. uberis (99, 799), S. dysgalactiae (B1) el cual se

agrupó con Streptococcus sp. (E1).

Figura 2. Electroforesis de ampliﬁcación de 16S por PCR convencional.

Figura 3. Electroforesis de ampliﬁcación de 16S por PCR convencional.

En la Tabla 2 se evidencian los géneros de los

agentes patógenos identiﬁcados en esta investiga-

ción, que son Staphylococcus, Sphingomonas yStrepto-

coccus. Existen bacterias que son componentes nor-

males de la microbiota cutánea, entre ellas bacte-

rias del género Sphingomonas yStreptococcus (Chen,

Fischbach y Belkaid, 2018).

Según Fariña y col. (2013), Sthaphylococcus es

uno de los géneros aislados con mayor frecuencia

en estudios de prevalencia de mastitis. Lange y col.

(2015) mencionan que las especies pertenecientes al

género Streptococcus están vinculadas con la mas-

titis bovina al ser bacterias oportunistas. Ruiz y col.

(2011) en un estudio sobre mastitis subclínica aso-

ciada al ordeño manual y mecánico determinan a

Staphylococcus sp. como el agente patógeno princi-

pal con un 61% de predominancia seguido de Strep-

LAGRANJA:Revista de Ciencias de la Vida 39(1) 2024:137-149.

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tococcus sp. con 29,6% de incidencia. Braga y col.

(2018) al realizar una identiﬁcación de patógenos de

la mastitis bovina por espectrofotometría de masas

MALDI-TOF determinaron que aproximadamente

el 80% de los casos de mastitis era ocasionado por

el grupo de bacterias Staphylococcus aureus, Strepto-

coccus uberis y Streptococcus dysgalactiae.

Figura 4. Árbol ﬁlogenético elaborado a partir de la secuenciación de la región 16S rRNA de las especies aisladas.

Fuente: elaboración propia, 2018

Davies y col. (2016) mencionan que el 63% de

los eventos potenciales de transmisión y el 38% de

incidencia de mastitis clínica es causada por S. ube-

ris en hatos lecheros. Nam y col. (2009) mencionan

que cerca del 40% de los casos de mastitis clínica

son originados por bacterias Gram (-) vinculadas a

la mastitis, y el patógeno no coliforme más común-

mente asociado con las infecciones intramamarias

es Sphingomonas sp.

3.3 Determinación de resistencia a antibió-

ticos

La ampliﬁcación del gen de resistencia blaTEM pa-

ra la familia de los β-lactámicos dio como resultado

bandas de aproximadamente 300 pb, datos corro-

borados por Tao y col. (2014). Se encontró el gen

de resistencia en las especies Staphylococcus pasteu-

ri, Staphylococcus warneri, Staphylococcus epidermi-

dis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus uberis,

Sphingomonas sp. y Staphylococcus aureus (Figura 5).

Por otra parte, la ampliﬁcación del gen de resis-

tencia tetA para la familia de las tetraciclinas dio co-

mo resultado bandas de aproximadamente 250 pb.

De acuerdo con Belding y Boopathy (2018), el gen

de resistencia para la familia de antibióticos tetra-

ciclinas posee un tamaño de entre 210 a 300 pb. Se

encontró el gen de resistencia en las especies Staphy-

lococcus pasteuri, Staphylococcus epidermidis, Strepto-

coccus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Staphylococ-

cus aureus ySphingomonas sp. (Figura 6).

144 LAGRANJA:Revista de Ciencias de la Vida 39(1) 2024:137-149.

Determinación molecular del agente etiológico de la mastitis bovina de muestras provenientes de

unidades productoras andinas

Figura 5. Gel de electroforesis que demuestra la presencia/ausencia del gen de resistencia blaTEM para antibióticos de la familia

β-lactámicos.

Figura 6. Gel de electroforesis que demuestra presencia/ausencia de gen de resistencia tetA para antibióticos de la familia de

tetracilcinas.

Corroborando los resultados obtenidos en es-

te estudio (Tabla 3), otros estudios de resistencia

a antibióticos en patógenos relacionados a mastitis

han determinado que las especies resistentes a β-

lactámicos son Staphylococcus warneri, Streptococcus

uberis (Bonetto, 2014), Staphylococcus epidermidis (Fa-

riña y col., 2013), Staphylococcus saprophyticus, Sphin-

gomonas sp., S. aureus (Ramírez, Fernández y Pala-

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cio, 2018) y Staphylococcus pasteuri (Arrepia, 2008).

De igual manera, de acuerdo con estudios realiza-

dos por otros autores las especies S. epidermidis pre-

sentan resistencia a tetraciclinas (Ramírez, Fernán-

dez y Palacio, 2018), S. uberis, S. dysgalactiae, (Flo-

rentin, 2007) y S. pasteuri (Savini y col., 2009), mos-

trando esta última resistencia a numerosas clases

de compuestos antibióticos como meticilina/ oxaci-

lina, macrólidos, lincosamidas, estreptograminas y

tetraciclinas.

Tabla 2. Clasiﬁcación taxonómica de los agentes etiológicos causantes de mastitis bovina aislados en los cantones de Cayambe y

Pedro Moncayo, provincia de Pichincha.

Código Especie

Query

cover

(%)

Identidad Acceso

835 Staphylococcus pasteuri 99 97 gi|388894673|JQ726643.1

A2r Staphylococcus pasteuri 100 99 gi|762210140|LN623633.1

D2r Staphylococcus sp. 98 99 gi|1193828147|MF112182.1

I2r Staphylococcus warneri 99 99 gi|1409189597|MF662223.1

A3r Staphylococcus sp.

strain CLC-F26 100 99 gi|1408623646|MH518208.1

809

Staphylococcus

epidermidis strain

TWSL_20

96 99 gi|846351151|KT184900.1

798 Staphylococcus sp. 91 98 gi|322180115|JF194710.1

799c1

Staphylococcus

saprophyticus strain

WWi167

99 99 gi|1393269660|MH396756.1

1C Sphingomonas sp.

strain Ap02E 78 89 gi|1080032407|KX990222.1

2C Sphingomonas sp. 97 91 gi|1193828182|MF112217.1

Streptococcus

dysgalactiae strain JZ

R-75

34 99 MH119693.1

E1 Streptococcus sp.

XJ150-1212-NJR1 95 90 gi|564983989|KF828882.1

99 Streptococcus uberis

strain NCTC4674 99 99 gi|1403452574|LS483408.1

799 Streptococcus uberis

strain NCTC3858 99 97 gi|1403426722|LS483397.1

Fuente: NCBI(2019).

4 Conclusiones

El uso de la técnica molecular permitió identiﬁ-

car género y especie en la mayoría de los micro-

organismos aislados, con lo cual se concluye que

la identiﬁcación molecular del agente etiológico es

importante en el estudio de la mastitis bovina al ser

una prueba más especíﬁca que las bioquímicas.

Se pudo determinar que los agentes etiológicos

de mayor prevalencia de mastitis bovina en los can-

tones Cayambe y Pedro Moncayo son los microor-

ganismos pertenecientes a los géneros Staphylococ-

cus yStreptococcus, siendo los más comunes Staphy-

lococcus pasteuri, Staphylococcus warneri, Staphylococ-

cus sp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus au-

reus, Staphylococcus saprophyticus, Sphingomonas sp.,

Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis.

146 LAGRANJA:Revista de Ciencias de la Vida 39(1) 2024:137-149.

Determinación molecular del agente etiológico de la mastitis bovina de muestras provenientes de

unidades productoras andinas

Tabla 3. Especies resistentes a β-lactámicos y tetracilinas

Especies con gen de

resistencia blaTEM

Especies con gen de

resistencia tetA

Staphylococcus pasteuri Staphylococcus pasteuri

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

Staphylococcus epidermidis Staphylococcus epidermidis

Streptococcus uberis Streptococcus uberis

Sphingomonas sp. Sphingomonas sp.

Staphylococcus warneri Streptococcus dysgalactiae

Staphylococcus saprophyticus

La técnica molecular también permitió identiﬁ-

car en las bacterias causantes de la mastitis bovina

la presencia de genes de resistencia a dos fami-

lias de antibióticos. Las bacterias resistentes a los

β-lactámicos fueron Staphylococcus pasteuri, Staphy-

lococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Strepto-

coccus uberis ySphingomonas sp; y las bacterias

determinadas como resistentes a las tetraciclinas

fueron Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus au-

reus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus uberis,

Sphingomonas sp., Streptococcus dysgalactiae.

La identiﬁcación molecular de diferentes géne-

ros y especies bacterianas causantes de la mastitis

bovina junto con el estudio de los genes de resis-

tencia a los antibióticos permite tener un diagnósti-

co más seguro para instaurar un tratamiento eﬁcaz

contra esta enfermedad multifactorial que aqueja a

las vacas lactantes en la gran mayoría de las unida-

des productivas lecheras del Ecuador.

Contribución de los autores

NFBG; Conceptualización, Administración del pro-

yecto, metodología Investigación, Responsabilidad,

Visualización, Escritura borrador original, revisión

y edición. XAGJ; Metodología, Investigación de

campo y laboratorio, muestreo de leche, micro-

biología, tratamiento de datos a nivel molecular.

BGFF; Metodología, investigación de laboratorio,

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