AISLAMIENTO, CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DE Trichoderma spp. COMO PROMOTOR DE CRECIMIENTO VEGETAL EN PASTURAS DE RAYGRASS (Lolium perenne) Y TRBOL BLANCO (Trifolium repens)
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AISLAMIENTO, CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DE Trichoderma spp. COMO PROMOTOR DE CRECIMIENTO VEGETAL EN PASTURAS DE RAYGRASS (Lolium perenne) Y TRBOL BLANCO (Trifolium repens)

ISOLATION, CHARACTERIZATION AND EVALUATION OF Trichoderma spp. AS PROMOTER OF PLANT GROWTH IN PASTURES OF RAYGRASS (Lolium perenne) AND WHITE CLOVER (Trifolium repens)

Ramiro Daniel Acurio Vsconez
Universidad Politcnica Salesiana, Ecuador
Cinthia Karina Espaa Imbaquingo
Universidad Politcnica Salesiana , Ecuador

AISLAMIENTO, CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DE Trichoderma spp. COMO PROMOTOR DE CRECIMIENTO VEGETAL EN PASTURAS DE RAYGRASS (Lolium perenne) Y TRBOL BLANCO (Trifolium repens)

LA GRANJA. Revista de Ciencias de la Vida, vol. 25, nm. 1, 2017

Universidad Politcnica Salesiana

Recepcin: 03 Octubre 2016

Aprobacin: 19 Diciembre 2016

Publicacin: 31 Diciembre 2016

Resumen: El gnero de hongos Trichoderma han sido muy utilizados en agricultura como controladores biolgicos gracias a su capacidad para excretar enzimas exgenas que les permiten actuar como biopesticidas. Este hongo tiene la capacidad de crecer en diversos hbitats, y se los encuentra comnmente en el suelo y en materia en descomposicin. Su papel como promotor de crecimiento vegetal se debe a la capacidad de colonizar rpidamente las races de la planta protegindolas del ataque de fitopatgenos, lo que se traduce en un incremento en el crecimiento y por la exudacin de fitohormonas o la solubilizacin de fosfatos, Fe, Mn, Mg. El objetivo de este trabajo fue aislar cepas nativas de Trichoderma spp. presentes en el suelo de la hacienda “La Alegra” ubicada en el cantn Pedro Moncayo para su posterior evaluacin como promotoras de crecimiento vegetal en pasturas de raygrass y trbol blanco. Las cepas aisladas fueron identificadas mediante claves morfolgicas como Trichoderma harzianum y Trichoderma viride. El efecto como promotor de crecimiento se evalu en campo, en potreros previamente establecidos. Se realizaron tres cortes con un periodo de 45 das, despus de cada corte se fertilizaron los potreros con soluciones lquidas del hongo a una concentracin de 106, materia orgnica (Compost 45% MO) y fertilizante qumico (Fertiforraje). Los tratamientos que mejores resulta- dos arrojaron fueron T1 con un promedio de materia verde de 12,72 TM/ha/corte y T6 con un promedio de 11,55 TM/ha/corte, en comparacin con el testigo y el tratamiento qumico.

Palabras clave: Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, promotor de crecimiento, raygrass, trbol blanco.

Abstract: The genus Trichoderma fungi have been widely used in agricultre as biological control method due to their capacity to excret exogenous enzymes allowing them to act as a biopesticide. This fungi has the ability to grow in diverse habitats and they are often finded in soil and decaying matter. Its role as a plant growth promoter is due to their ability to rapidly colonize the roots of the plant, protecting them from the attact of phytopathogenic fungi. This proces results in increased growth and exudation of phytohormones or solubilizing phosphates as Fe, Mn, Mg. The objective of this study was to isolate native strains of Trichoderma spp. present in the soil of the farm “La Alegra” located in the canton Pedro Moncayo, for subsequent evaluation as promoters of growth in raygrass and white clover. The isolated strains were identified as Trichoderma harzianum and Trichoderma viride. The effect as growth promoter was in previously established pasture fields. We made three cuts with a 45 days period, after each cut we fertilized the pastures with liquid solutions of the fungus at a concentration of 106, organic matter (compost 45 % MO) and chemical fertilizer (Fertiforraje). The treatments that work the best were the T1 with green matter of 12,72 MT/Ha/cut and T6 with an average of 11,55 MT/ha/cut, compared with the controller and the chemical fertilizer.

Keywords: Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, growth promoter, raygrass, white clover.

Forma sugerida de citar:

Acurio, R. y C. Espaa. 2017. Aislamiento, caracterizacin y evaluacin de Trichoderma spp. como promotor de crecimiento vegetal en pasturas de raygrass (Lolium perenne) y trbol blanco (Trifolium repens). La Granja: Revista de Ciencias de la Vida. Vol. 25(1):53-61. pISSN:1390-3799; eISSN:1390-8596

1 Introduccin

En la zona norte de los cantones Cayambe y Pedro Moncayo, en los ltimos aos la actividad ganadera ha ido ganando mucho espacio, por lo tanto se ha aumentado el uso de suelo para la produccin de forraje. Sin embargo, “la produccin de pastos y forrajes se enfrenta a diversos problemas como son la baja estabilidad y persistencia, mismos que se encuentran directamente relacionados con factores qumicos, fsicos y medio ambientales”, pgina 14 de (Mndez, 2010).

La autora (Torres, 2009), seala que las especies forrajeras son las ms utilizadas en la alimentacin del ganado, esto debido a que su produccin es ms econmica, razn por la cual el forraje se ha convertido en la base de la actividad, por lo que es necesario prestar especial atencin en su produccin, la cual por ahora es totalmente convencional, especial- mente lo relacionado con el uso de fertilizantes.

La mayora de productores con la finalidad de mejorar la fertilidad del suelo y de esta forma acelerar la produccin, as como tambin para obtener una buena calidad en sus pastos, se han inclinado por el uso de fertilizantes qumicos, que si bien es cierto presentan y proporcionan los efectos deseados, a largo plazo ocasionan serios inconvenientes para el ambiente, “causando problemas de salinizacin en el suelo, factor que constituye un limitante para el rendimiento y calidad de lo que ah se cultiva, adems de los efectos nocivos sobre la salud de las personas”, pgina 15 de (Mndez, 2010).

Una alternativa para mejorar la fertilidad de los suelos dedicados a la produccin de forrajes es el uso de hongos del gnero Trichoderma spp., “las especies de este gnero son hongos de vida libre, altamente interactivos en las races del suelo y ambiente foliar, con una gran capacidad de inactivar exudados originados en las semillas en germinacin”. Actualmente, est siendo muy utilizado en diversos cultivos debido al excelente trabajo que realiza como controlador biolgico, tambin parece ser que acta como promotor de crecimiento (Howell, 2002), pgina 5.

En varios estudios similares de control de patgenos se ha observado que T. harzianum no slo redujo la severidad de las enfermedades, sino que tambin indujo la estimulacin del crecimiento de las plantas, existiendo reportes en especies herbceas como lechuga, maz, tabaco, zapallo, petunia y tomate (Donoso y Lobos, 2008).

Todos los mecanismos de accin de T. harzianum se basan en el principal papel como promotor de crecimiento vegetal que tiene, el cual se manifiesta desde las primeras fases de la plntula, y que le confiere mayores ventajas a la hora del trasplante. T. harzianum se asocia a las races de la planta proporcionndole un mayor vigor y crecimiento (Galeano, 2008). La presente investigacin busco aislar Trichoderma spp., hongo nativo de la zona de estudio, para su posterior caracterizacin y propagacin en el laboratorio. Asimismo, se evalu en campo el efecto que ste posee sobre el crecimiento del forraje mediante su inoculacin en los potreros existentes en el campo.

2 Materiales y mtodos

2.1 Ubicacin fase de laboratorio

La fase experimental se llev a cabo en el laboratorio de microbiologa de la Universidad Politcnica Salesiana del CIVABI que se encuentra ubicado en el Distrito Metropolitano de Quito de la provincia de Pichincha, Ecuador.

2.2 Muestreo del suelo

Con el objetivo de aislar cepas nativas de Trichoderma spp. se extrajeron muestras de suelo de la hacienda “La Alegra” ubicada en el cantn Pedro Moncayo. Con la ayuda de una barra y una pala limpias, a una profundidad de 10-20 cm, se procedi a tomar submuestras de suelo, las que fueron depositadas en un recipiente plstico limpio para formar as una muestra completa. A continuacin se tom 500 g de suelo, que fueron colocados en fundas plsticas y etiquetados debidamente para su respectivo procesamiento.

2.3 Aislamiento y purificacin de cepas de Trichoderma

De cada muestra se tom 5 g de suelo que fueron colocados en fundas estriles con 50 ml de solucin de cloruro de sodio al 1%. Se agitaron las muestras manualmente por 15 minutos. De cada muestra se procedi a tomar 100 l y se inocul en cajas Petri con medio Agar Sabouraud Dextrosa. Las cajas fueron selladas con parafilme incubadas a 26C durante 7 das o hasta el aparecimiento de las colonias de Trichoderma. Para la purificacin las colonias identificadas como Trichoderma se realiz transferencia directa cajas Petri con medio PDA (Girard, 1964).

2.4 Mantenimiento de cepas de Trichoderma

Para el mantenimiento de las cepas stas fuerontransferidas a tubos con medio PDA. Los tubos fueron sellados con para film e incubados a 26C durante 2 a 3 das o hasta observar el aparecimiento de micelio y esporas. Se aadi a los tubos aceite de vaselina, los mismos que fueron sellados con para filmy colocados en refrigeracin (Lpez, 2007).

2.5 Identificacin de microorganismos aislados

La identificacin de aislados se realiz mediante reconocimiento de crecimiento de estructuras microscpicas (hifas, esporas y clamidosporas) y macroscpicas (color de micelio, forma de micelio y crecimiento). Las caractersticas macro y microscpicas fueron cotejadas con las claves de identificacin de gneros de Deuteromycetes (Gams, 1998), para especies de Trichoderma (Girard, 1964) y la clave interactiva de la APS (Samuels, 2006).

2.6 Multiplicacin masiva de Trichoderma

Se colocaron 50 g de sustrato (arroz) cocido en recipientesde vidrio, se sellaron y se colocaron en la autoclave durante 10 minutos a 120C. Para la inoculacinde T. harzianum y T. viride en los sustratos, se requiri de cultivos puros de los hongos, cada recipiente con el sustrato estril, fue inoculado con 5ml de una suspensin de conidios, previamente preparada a una concentracin de 108 conidios/ml, finalmente se incub a 12 h luz/oscuridad a 26C por10 das (Sivila, 2013).

2.7 Fase de campo

2.7.1 Instalacin del ensayo

Cada unidad experimental se conform por una mezcla de Ray Grass Perenne y Trbol Blanco dispuesta en una parcela de 2,5 metros de largo por 1,5 de ancho, (3,75 m2), para el efecto se utiliz flexmetro, piola y estacas. Adicionalmente, para un mejor manejo de la investigacin se identificaron en todas las unidades experimentales las caractersticas de cada tratamiento.

2.7.2 Fertilizacin

La fertilizacin se la realiz cinco das despus del corte de la pastura y en funcin de los tratamientos, los periodos de cortes fueron de 35 das y se realiz un total de tres aplicaciones. El sustrato slido con Trichoderma se diluy en agua hasta una concentracin de 106, se aplic en los potreros mediante una bomba de mochila en forma de drench. Adicionalmente se aplic materia orgnica (compost con 45% MO) y fertilizante qumico sinttico (Fertiforraje) para realizar las respectivas comparaciones.

El diseo experimental utilizado fue un DBCA con arreglo factorial 23 + 2 y con tres repeticiones para los factores especie de Trichoderma (viride, harzianum), materia orgnica (aplicacin y no aplicacin) y fertiforraje (dosis alta de 300 Kg/ Ha y dosis baja de 150 Kg/ha).

2.8 Determinacin del rendimiento de materia verde

Para determinar la produccin de materia verde de la mezcla de pastos, de cada una de las unidades experimentales se procedi al corte de 1 m2 con la ayuda de una hoz y de un cuadrante de varilla metlico, posteriormente con una motoguadaa se realiz el corte de igualacin del resto de la unidad experimental. La biomasa fue colocada en fundas y pesada para determinar el rendimiento de materia verde.

2.9 Determinacin de materia seca

De las muestras de pastos se tomaron 2 submuestras de 100 g cada una y sometidas a una temperatura de 105C por 24 horas para as determinar el rendimiento en materia seca por diferencia de peso.

3 Resultados y discusin

3.1 Identificacin macroscpica de T. viride

Las colonias presentaron un crecimiento rpido (5-8 cm), el micelio logr cubrir la superficie de los medios de cultivo en 5 das a 26C en Agar papadextrosa. Las colonias al inicio formaron pstulas algodonosas de un color blanco, posteriormente se compactaron y esporularon tomando un color verde de textura granular, con conidiforos ramificados visibles alrededor de la pstula. Los aislados nopresentaron el olor caracterstico a coco; sin embargo al inverso de las colonias se puede observar visiblemente una coloracin marrn-amarillenta, esto debido a la produccin de cristales de color amarillo como se muestra en la Figura 1(c,d). Resultadosque concuerdan con las descripciones realizadaspor (Gams y Bissett, 1998).

3.2 Identificacin microscpica de T. viride

Tal como se muestra en la Figura 1(a,b), los conidiforos mostraron ramas laterales pareadas las mismas que forman un ngulo de 90 con respecto al eje de donde surgen. Las filides presentaron una forma alargada, algo anchas en el centro y con un cuello alargado de color hialino. En ocasiones se observ filides individuales mientras que en otros casos se las encontr en grupos de 2 a 3. Las conidias observadas tenan forma ovoidal y a veces globosa, adems tenan un color verde claro y los bordes lisos. Las conidias se presentaron incrustadas en las filides a manera de un racimo globoso de umbelas bien definidas. Todo lo anteriormente descrito fue comparado con las claves de identificacin taxonmicas tanto de (Samuels et al., 1996) como de (Gams y Bissett, 1998) y concuerdan con la especie Trichoderma viride.

Estructuras microscpicas y macroscpicas de T viride. A) Conidios a los 5 das de
incubacin. B) Forma de los conidiforos.) C) Formacin de
anillos concntricos. D) Pigmentacin del medio.
Figura 1.
Estructuras microscpicas y macroscpicas de T viride. A) Conidios a los 5 das de incubacin. B) Forma de los conidiforos.) C) Formacin de anillos concntricos. D) Pigmentacin del medio.

3.3 Identificacin macroscpica de T. harzianum

Las colonias tuvieron un radio de 5 a 6 cm, con apariencia aterciopelada en sus etapas tempranas, el micelio present un color blanco sin embargo eventualmente fue desarrollando un color blanco verdoso hasta dar una tonalidad verde oliva, adems se produjo la formacin de anillos concntricos los mismos que son caractersticos del gnero Trichoderma. Despus de 7 das de incubacin a 25C las colonias presentaron un radio de 9 cm y cubriendo toda la superficie de la caja Petri y presentaron un color verde obscuro, fueron densas en el centro y se tornaron ondulatorias en los anillos concntricos hasta llegar a los bordes. Todas las caractersticas mencionadas anteriormente fueron comparadas con las descripciones realizadas por Gams y Bissett,(1998), as como tambin por las descritas por (Samuels et al., 1996), mismas que concuerdan y correspondena la especie de Trichoderma harzianum y se observan en la Figura 2(c,d).

Estructuras microscpicas y macroscpicas
de T. harzianum. A y B) Conidiforos
a los 5 das de incubacin. C) Formacin de anillos concntricos. D)
Crecimiento en el medio.
Figura 2.
Estructuras microscpicas y macroscpicas de T. harzianum. A y B) Conidiforos a los 5 das de incubacin. C) Formacin de anillos concntricos. D) Crecimiento en el medio.

3.4 Identificacin microscpica de T. harzianum

Los conidiforos observados a los 5 das de incubacin presentaron una ramificacin piramidal, “dentro de este sistema de ramificacin se puede observar que las ramas o brazos que se encuentran ms cercanos al eje principal son ms largas”; esta descripcin coincide con la hecha por (Samuels et al.,1996), prrafo 1, este mismo autor seala que las ramas que se encuentran ms cercanas a la punta forman un ngulo de 90 con respecto al eje de donde nacen mientras que las ramas que se encuentran ms lejanas a la punta forman un ngulo menor a 90 con respecto al eje de donde surgen. “Las filides presentan forma de botella esto se debe a queson ms anchas en el centro y se van comprimiendo fuertemente conforme se acercan a la punta hasta formar una especie de cuello”.

3.5 Rendimientos de materia verde y materia seca

El tratamiento que report un mejor desarrollo con un (p< 0, 001) durante los tres cortes realizados en la variable produccin de materia verde, se presenta en la Figura 3, y fue T1 (Trichoderma harzianum + Materia orgnica + Fertilizacin alta) con una produccin promedio de 12,72 TM/Ha/corte y T6 (Trichoderma viride + Materia orgnica + Fertilizacin baja). De igual forma T1 mostr el mejor comportamiento para la variable produccin de materia seca con un promedio de 1,97 TM/Ha/corte. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en diferentes estudios donde se muestran que las cepas de Trichoderma promueven el crecimiento radicular en plantas de maz y de algunos pastos, adems mencionan que “al existir un incremento en la longitud de las races colonizadas por Trichoderma, las plantas de maz y algunos pastos colonizadas por este hongo requirieron un 40% menos de fertilizantes nitrogenados” (Harman et al., 2004), pgina 152. Por otro lado existen diversos trabajos donde se asegura que las especies de Trichoderma para poder colonizar las races de la planta son capaces sintetizar un sin nmero de sustancias como pptidos que actan como promotores de crecimiento, esto es demostrado por Wei Lin y Zhang, (2006), que mediante la aplicacin de un proceso de fermentacin lquida de Trichoder ma harzianum lograron obtener sustancias promotoras de crecimiento como cido indolactico y cido giberlico, las cuales son una clase de pptidos y son reconocidas como fitohormonas (Wei Lin yZhang, 2006).

Cabe sealar que el aporte de materia orgnica jug un papel importante en la produccin tanto de materia verde como de materia seca, ya que en los tratamientos donde se agreg materia orgnica se registr un mejor comportamiento en comparacin con el testigo y el tratamiento donde solo se utiliz fertilizante qumico. La interaccin (TH:1:A) present la mayor proporcin de materia seca en gramos pero no tiene diferencia significativa con (TV:1:B), lo cual demuestra que la aplicacin del hongo en presencia de materia orgnica puede reducir la cantidad de fertilizante sinttico. Trichoderma tiene la capacidad de degradar la materia orgnica y solubilizar fosfatos orgnicos e inorgnicos mediante mecanismos quelantes y reductores (Cubillos et al., 2009).

En el trabajo realizado por Garcs (2011), se menciona que tanto “la altura como la produccin de materia verde en alfalfa, se vieron incrementadas al aadir abono orgnico slido enriquecido con Trichoderma, los abonos orgnicos presentan un elevado contenido de aminocidos libres por lo que acta como activador del desarrollo vegetal”, pgina 76.

Prueba de Duncan al 5% para la interaccin Trichoderma*Materia
orgnica*Fertilizacin en la variable materia seca (g). TV: T. Viride, TH: T. Harzianum, 0: sin materia orgnica, 1: con materia orgnica, A: Fertilizacin Alta, B: Fertilizacin Baja.
Figura 3.
Prueba de Duncan al 5% para la interaccin Trichoderma*Materia orgnica*Fertilizacin en la variable materia seca (g). TV: T. Viride, TH: T. Harzianum, 0: sin materia orgnica, 1: con materia orgnica, A: Fertilizacin Alta, B: Fertilizacin Baja.

4 Conclusiones

Dentro de la zona de estudio se logr aislar y caracterizar dos especies, T. harzianum y T. viride. Este hongo favorece el crecimiento de pasturas asocia- das de Raygrass y Trbol Blanco aumentando el rendimiento con respecto a la materia verde y materia seca. La incorporacin de materia orgnica permite obtener mejores resultados en la absorcin de nutrientes y desarrollo de microorganismos en el suelo, evidenciando que T. viride puede reducir el uso de fertilizantes de sntesis qumica cuando se aplica junto con la materia orgnica.

Agradecimientos

Agradecemos al Ing. Janss Beltrn y la MSc. Nancy Bonifaz que nos facilitaron el trabajo en la hacienda “La Alegra” para el desarrollo de esta investigacin.

Referencias

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Wei Lin, L. Z.-H. y Z. G.-R. Zhang. 2006. Effects of Peptide in the Fermentation Liquid of Trichoderma harzianum on Nodule Microstructure and Function of Cowpea. Acta Laser Biology Sinica. 84-89.

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